PCR检测儿童微小残留白血病

2010-7-24 14:47:40 | 作者：yatao | 0个评论 | 人浏览

PCR检测儿童微小残留白血病
微小残留白血病（minimal residual disease， MRD）是指白血病经化疗取得完全缓解后，骨髓中仍存在形态上不能检测到的白血病细胞，是引起白血病复发的主要原因。准确测定MRD对临床制定治疗方案具有重要意义。目前用于检测MRD的方法有核型分析、荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）、流式细胞术（flowcytometric immunophenotyping, FCM）、Southern blot和PCR等，不同方法各有利弊。核型分析、FISH、FCM和Southern blot等的敏感性分别为10-1-10-2、10-2、10-3-10-4和10-1，难以满足对MRD诊断的需要，且都存在或操作费时，或费用较高，或对样本要求较高等不足之处。相对而言，PCR检测MRD的敏感性可达10-4-10-6，且具有快速、特异、简便、经济、样本量少等优点，因此用于MRD检测独具优势。本文综述PCR在儿童急性白血病MRD检测中的应用研究进展。

初诊白血病靶分子的初筛——多重PCR

在白血病初诊时筛选肿瘤标志，可作为MRD追踪的靶目标。而肿瘤标志的筛选需考虑样本用量、费用、效率等问题。多重PCR（multiplex PCR）是在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，可一次性筛选出目的DNA，具有检测的覆盖面较广、效率较高、费用相对较低等优点，目前国际上通常采用此法作为白血病肿瘤标志的初筛。

多重PCR初筛融合基因的临床意义 目前已经发现的、与白血病相关的融合基因有50多种，由于其在白血病的发展过程中比较稳定，因此可作为白血病初筛及MRD追踪的标志。融合基因在各种白血病中的发生率： 在急性前B淋巴细胞白血病（preBcell acute lymphoblastic leukemia, preB ALL ）中为40%-50%，在T淋巴细胞白血病（Tcell acute lymphoblastic leukemia, TALL）中为10%-25%，在急性髓系细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）中约为30% ［1］。

Pallisgaard等建立一种逆转录多重巢式PCR(multiplex RTPCR )方法。他们设立了8个PCR管，进行逆转录多重巢式PCR，用于筛选急性白血病中29种染色体易位（超过80种融合基因）。样本包括102例AML、62例儿童ALL患者的冻存或新鲜骨髓和外周血。结果显示： 44% AML，45% ALL患者融合基因阳性，而在融合基因阳性的标本中33% AML及47% ALL用常规的细胞遗传学方法不能检测出来。

Olesen等［2］用逆转录多重巢式PCR和传统细胞遗传学方法同时检测了AML、ALL等共328例病人的骨髓和外周血标本。结果显示：融合基因检测阳性率为25%，细胞遗传学检测阳性率为15%；在88例儿童标本中，两种方法检测均阳性的占28%，但其中16%核型分析并没有发现染色体易位，而是检测出另一些染色体畸变。

由欧洲8国14个实验室共同参与研究制定的"急性白血病MRD分析：国际标准和临床评价行动"（BIOMED1行动），针对与预后相关性较大的9种染色体畸变，建立了一套标准化的多重PCR方法检测MRD ［4］，使MRD的检测具有统一的标准和质量控制。

多重PCR 初筛融合基因应注意的问题 综合目前的文献，在设计多重PCR检测融合基因时需考虑下列问题： ①在RNA水平上检测融合基因：由于大部分断裂点融合区长度超过10 kB，常规PCR较难扩增如此长的序列，而且大部分断裂点跨过一个或几个内含子，使得在DNA水平上确定这些融合基因变得繁琐和耗时。但如果以融合mRNA为模板逆转录出cDNA，就可以解决上述问题。②逆转录引物的设计：目前通常以随机引物或多聚dT引物逆转录cDNA，如设计融合基因特异的cDNA引物进行逆转录，可使特异性增强25-125倍。③增设"移位引物"（shifted primers）以减少假阳性发生：为排除假阳性结果，可在外引物的外侧再设计1对"移位引物"，当巢式PCR结果为阳性时，再以1侧"移位引物"和另1侧内引物扩增原始模板，或在第1轮PCR后，以内引物为探针进行点杂交。

Ig/TCR基因重排的初筛

多重PCR初筛Ig/TCR基因重排的临床意义 在淋巴细胞早期分化过程中，Ig和TCR的VDJ基因发生重排，使得每个淋巴细胞均有一个特异性VDJ基因组合编码的Ig或TCR分子可变区。而在VDJ基因连接部，DNA片段的随机插入或缺失又增加了连接区序列的多变性。恶性肿瘤都是单克隆来源的，即同一患者的所有肿瘤细胞连接区的序列是一致的，因此可以作为肿瘤特异性标志。

以Ig/TCR基因重排为靶基因的优点是其在白血病中发生率较高，见于95%以上儿童ALL和约10%AML［1］。但30%-50%儿童白血病病程中，Ig/TCR分子可形成寡克隆或发生克隆演化，因此以此作为MRD追踪的标志，易出现假阴性结果。

欧洲BIOMED1行动以TCRD、TCRG、IGK（Kde）等3个基因以及TAL1缺失为靶目标，设计54对引物，25管PCR反应，其对ALL检测的覆盖率超过90%。随后再根据PCR产物的测序结果设计特异性寡核苷酸（allelespecific oligonucleotide， ASO）探针或引物进行MRD追踪［5］。结果显示： TCRD、TCRG、IgK/Kde基因重排在儿童preBALL中的发生率分别为55%、60%和50%，在儿童TALL中为50%、90%和0%，同时存在两种基因重排的发生率： preBALL为70%，TALL为90%。欧洲BIOMED2行动则在BIOMED1行动的基础上，对多重PCR方法进行改良，设计107对引物，18管PCR反应，即可检测所有Ig/TCR基因重排［3］。

多重PCR初筛Ig/TCR基因重排应注意的问题 ①引物设计： Ig/TCR基因的V、D、J区数量多、变化大，针对每个基因设计引物进行PCR反应是不可行的。引物设计的原则是：在不同家族的V区保守序列上设计一条家族引物(family primer)作为上游引物，以J区保守序列上的共有引物(consensus primer)作为下游引物，可以减少PCR反应管数。另外，也可针对重排发生率高的V区设计引物。②结果分析： Ig/TCR基因PCR产物有多克隆（正常淋巴细胞在不同抗原刺激下经高频体细胞突变后的产物）、单克隆（来源于肿瘤细胞的一种重排）和寡克隆（来源于肿瘤细胞的两种或两种以上重排），以琼脂糖凝胶电泳难以将三者区别开来，目前常用异源二聚体分析和基因扫描分析Ig/TCR基因PCR产物，以鉴别单克隆淋巴细胞和多克隆淋巴细胞。异源二聚体分析具有方法简单、迅速、价廉等优点，敏感性约5%，但其结果易受多克隆淋巴细胞数量的影响。基因扫描分析的敏感性可达0.5%-1%，但需要专门的检测设备。

MRD的追踪——荧光定量PCR

目前对MRD进行定量监测的方法有极量稀释法、竞争PCR、荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR, FQPCR）等，但前两者有步骤繁琐、费时、费力，且易污染、不准确、灵敏度低等缺点。而FQPCR能较好地解决上述问题。FQPCR方法结合探针和引物的合理搭配，以Ig/TCR重排、染色体易位断裂融合区为标志，可对急性白血病的MRD进行快速、精确的量化检测［4］。由欧洲10个国家26个实验室共同参与研究制定的“欧洲防癌计划——MRD的FQPCR检测”，通过以FQPCR方法对15种常见的融合基因进行检测，建立了一套标准化的MRD的FQPCR检测方法，以评价各个化疗方案的相对有效性。该标准化方法在儿童及成人ALL及AML中的检出率达30%-40%，在CML中超过95%［5］。

目前追踪MRD常用的靶基因及其临床意义

bcrabl融合基因 产生于t(9;22)(q34;q11)，在儿童ALL的发生率为3%-5%［7］，是儿童ALL预后不良的独立因素。Scheuring等［7］追踪了56例bcrabl融合基因阳性的ALL患者，经格列卫（STI571）治疗后，全部bcrabl水平均下降，但随后其中24例bcrabl水平又回升，这24例最后全部复发。分析显示：复发时间与bcrabl降至最低点时的水平、bcrabl回升的幅度和速度等相关。外周血bcrabl相对拷贝数的最低值高于或低于5×10-4者，平均复发时间分别为27天和83天；回升幅度高于或低于2个log值者，平均复发时间分别为22天和83天，平均生存时间分别为47和312天；回升速度超过或低于1.25 log/month者，平均复发时间分别为39天和157天。骨髓bcrabl相对拷贝数的最低点高于或低于1×10-4者，平均复发时间分别为26天和81天；回升速度高于或低于0.6 log/month者，平均复发时间分别为33天和157天。

telaml1融合基因 产生于t(12;21)(p13;q22)，在儿童ALL中的发生率为25%［9］，是预后良好的指标，应将其作为MRD监测的常规指标。Taube等［9］用FQPCR方法比较了talaml1和Ig/TCR作为靶基因的敏感性，结果发现两者敏感性一致。Pine等［10］追踪了24例telaml1阳性的儿童前BALL，其中4例复发，与初诊比较，复发时的肿瘤细胞核型、表面抗原及Ig/TCR基因重排均发生了改变，而telaml1融合基因则持续存在，且其DNA序列与初诊时相同，说明telaml1的表达较Ig/TCR稳定。

IgH基因重排 在BALL的发生率为95%［11］，是目前BALL患儿MRD追踪的主要标志，但在疾病发展过程中约30%-40%病例发生克隆演化，极易导致MRD检测结果呈假阴性。IgH寡克隆形成及克隆演化的发生机制为VV片段置换和VHDJH前体重排，但不累及DJ序列，因此应用特异性PCR引物扩增DJ区，可使克隆演化所致的假阴性减少。Donovan等［12］对151例儿童BALL的IgH重排进行扩增和测序。根据测序结果，在J区上的FR3区域设计7条探针，配合ASO引物，进行FQPCR，追踪了16例患儿IgH重排数量的变化。结果显示：取得持续完全缓解的10例患者，IgH重排的相对拷贝数从初诊时的5×103-5×105逐渐下降至低于检测水平（<10-4）。其余6例的IgH重排拷贝数虽然在治疗开始后有所下降，但随后逐渐升高，最终全部复发。
IgKKde基因重排 Kde (Kappa deleting element)是位于JκCκ区下游24 kb处的1个结构，能与Vκ、JκCκ内含子中的重组信号序列（recombination signal sequence， RSS）发生重排。IgKKde重排作为FQPCR检测的靶基因有两个优点：①相对稳定，因Kde结构中参与重排的是RSS，其缺失后并不能发生再次重排，因此被称为"最后阶段的重排"，另外其寡克隆发生率小于10%，且容易消失，不会在疾病过程中出现寡克隆形式的基因重排。②IgKKde重排只包含一个功能区（VκKde或RSSKde），以序列相对有限的功能区为模板设计ASO引物相对简单。Dongen等［3］的统计显示：儿童前BALL发生IgKKde重排者约50%，其中VκKde为69%，RSSKde为31%。Velden等［13］以IgKKde重排为靶基因，利用BIOMED1相关行动提供的多重 IgK PCR方法对77例儿童前BALL进行检测，结果显示与Southern blot符合率达91%，94% IgKKde重排在初诊和复发时是一致的。对8例复发患儿进行随访，其FQPCR结果与ASO探针的点杂交结果完全一致，且敏感度大于10-4。鉴于IgKKde重排在前BALL中的高发生率、高稳定性，以及FQPCR检测的高敏感性，提示IgKKde重排可作为BALL患者MRD追踪的较好指标。

BFM协作组［15］以Ig/TCR重排为靶基因，追踪240例ALL患儿的MRD，共观察T1（诱导后）、T2（巩固前）和T5(化疗后1年)等9个时间点，根据MRD水平将患儿分为3组：低危（LR）组（T1、T2两个时间点MRD均为阴性）、高危（HR）组（T1、T2两个时间点MRD水平≥10-3）和中危（IR）组（低危和高危以外患者）。结果显示： 3组的3年复发率分别为2%、75%和23%；MRD在T1转为阴性者的3年复发率远低于T2转为阴性者（2% vs 23%）；IR组患儿T5时MRD阴性和阳性的3年复发率分别为10%和67%，差别有显著的统计学意义。因此认为，T1和T2的MRD水平对预测复发风险最有意义，T1的MRD可识别LR患儿，T2的MRD识别HR患儿，T5的MRD可预测IR患儿预后。

融合基因在白血病病程中表达稳定，无寡克隆和克隆演化形成的风险，初筛方法简便，但其在儿童白血病中的发生率较低；而Ig/TCR在儿童白血病中的发生率较融合基因高，但存在寡克隆和克隆演化形成的风险，必须根据每一病例设计特异性探针和引物。因此，两者在MRD检测中有互补意义。

FQPCR追踪MRD需注意的问题

探针和引物的设计 由于每例白血病均有特异的Ig/TCR重排，因此探针和引物的设计是提高FQPCR特异性的关键。目前常用两类探针： ①ASO探针，即以Ig/TCR基因中的保守序列设计共有引物进行PCR，扩增出标本中的肿瘤克隆，再对PCR产物测序，根据测序结果为每个病例设计1条ASO探针，然后配合两端的胚系引物进行FQPCR。ASO探针可排除其它淋巴细胞的干扰。②针对保守区设计的探针，即针对每个病例合成1条克隆特异性的ASO探针较昂贵，Verhagen等［14］人的研究解决了这一问题：他们选择在IgH的胚系J区设计探针和家族特异的下游引物，在多变的连接区设计ASO作为上游引物，进行FQPCR，从而实现对多变Ig/TCR的定量检测。此法较ASO探针联合胚系引物进行FQPCR更为敏感（前者为10-4-10-5，后者10-3-10-5），原因可能是ASO引物消除了正常淋巴细胞克隆与肿瘤克隆之间的竞争。

靶基因的选择 作为MRD动态监测的靶基因，应具备以下条件： ①在白血病中发生率较高。②在疾病发展过程中能稳定表达。③特异性探针和引物的设计相对容易。而各种融合基因和Ig/TCR基因重排有各自的特点，因此在实际应用中需全面考虑，寻找合理的解决办法。

检测范围的确定 由于FQPCR检测的高度敏感性，当样本中目的基因含量太低时，需要对定量值进行可信性分析。Ballerini等［15］以表达tam/aml1融合基因的Reh细胞株RNA为标准品，摸索tam/aml1的定量检测范围: 当把1 μg RNA稀释104倍时，可以检测到tel/aml1 cDNA的平均循环阈值（cycle threshold， CT）为37.8，各PCR反应管之间CT值的变异系数（coefficient of variation, CV）为0.8%-2.4%；但将RNA进一步稀释至5×104倍和105倍时，可检测到tel/aml1 cDNA的CT值超过40，其CV超过2.5%。此情况提示此定量结果并不可靠。因此靶基因的FQPCR检测范围及其定量值的可信度，应通过对标准品倍比稀释进行FQPCR，以获得CT值的CV来确定。

小 结

PCR作为MRD检测的重要方法，将白血病分子水平的改变与临床表现及预后联系起来，对白血病的诊治具有指导意义。然而，PCR技术本身仍存在一定的局限性，如每次反应检测的靶基因种类有限、反应体系和条件的不同可导致结果的差异等，在判断其结果时，应结合临床和其它实验室资料进行综合分析。近年来发展的PCR基因芯片技术，综合了基因芯片技术高效、微型化、自动化，以及PCR技术敏感、特异的优点，将弥补单纯PCR检测MRD的不足。

MRD检测的目的是建立分子生物学水平的CR标准，以指导临床判断预后、制定治疗方案。为此，需要对大量病例进行长期随访。MRD检测方法学的建立和标准化，及其在全国范围的规范性使用，应与白血病的全国诊疗方案处于同等重要的地位。

 

 

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